За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в технологиях секвенирования. После метода Сэнгера принятого как золотой стандарт, высокопроизводительное секвенирование нового поколения (NGS) получило широкое распространение в биомедицинских лабораториях. Первый позволяет анализировать один сегмент ДНК за один подход трудоемким способом, тогда как второй подход, заключаясь в одновременном анализе нескольких геномных областей, позволяет значительно снизить стоимость прочтения одной пары оснований.
В настоящее время высокопроизводительными инструментами секвенирования следующего поколения, которые в основном используются в биомедицинских лабораториях, являются секвенаторы Ion Torrent (Life Technologies) и платформы Illumina (Illumina).
Все технологии NGS основаны на одном и том же общем процессе, включающем подготовку шаблона, секвенирование и анализ данных. Уникальная комбинация конкретных технических деталей отличает одну технологию от другой и определяет тип данных, полученных на каждой платформе.
После извлечения ДНК первым этапом процесса секвенирования является подготовка библиотеки, которая заключается в лигировании фрагментов ДНК с специфическими олигонуклеотидными адаптерами. После этого каждый фрагмент иммобилизуют и амплифицируют. В подходе Life Technologies клональная амплификация осуществляется с помощью эмульсионной ПЦР, в которой фрагменты ДНК амплифицируются на поверхности шариков в масляно-водной смеси.
Для секвенирования Life Technologies использовали нативный химический дезоксинуклеотидтрифосфат (dNTP) во время включения оснований ДНК-полимеразой, которая связывает ионы водорода, вызывая изменение pH реакционной смеси, фиксируемое модифицированным кремниевым чипом.
В последние годы появление настольных платформ для секвенирования нового поколения на рынке оказало впечатляющее влияние на электронику благодаря огромному количеству данных, полученных со значительным сокращением времени и затрат. Действительно, NGS применялся в различных контекстах, ограничиваясь не только геномикой, но также транскриптомикой и эпигеномикой, например, при профилировании некодирующей экспрессии РНК, поиске сайтов связывания транскрипционных факторов, секвенирования РНК-секв.
В научных генетических исследованиях NGS успешно использовался для выявления новых причинных генов или вариантов, связанных с наследственными заболеваниями, особенно при генетически гетерогенных расстройствах, основа которых была частично неизвестна и в которых подход секвенирования генов за по Сэнгеру не был бы экономичным или эффективный. С этой целью NGS был применен для целого генома, экзома или целевого секвенирования, что привело к улучшению современных знаний о генетической основе нескольких патологий, таких как пигментный ретинит, кардиомиопатия или наследственный рак.
В последнее время широкое использование этих быстрых высокопроизводительных технологий, улучшение их производительности и преодоление первоначальных технических ограничений стимулируют их переход от базовых исследований к клиникам с важными преимуществами для рутинного ведения пациентов.
По материалам сайта официального дистрибьютора Thermo Scientific компании Пущинские лаборатории.
